Efeitos citotóxicos do teniposide, um derivado semi-sintético das epipodofilotoxinas, sobre linhagens celulares de carcinoma renal humano

O câncer renal corresponde a aproximadamente 3% dos tumores malignos do adulto, sendo a terceira malignidade urológica mais comum. Os tratamentos sistêmicos disponíveis para pacientes portadores de carcinoma renal avançado são, via de regra, pouco eficazes e sem um impacto definido na sobrevida. Portanto, torna-se imperioso que novos agentes e/ou estratégias terapêuticas para esta enfermidade sejam desenvolvidas. O derivado das epipodolofilotoxinas, etoposide, tem sido utilizado com sucesso no tratamento de vários tipos de tumores sólidos e hematológicos. Este agente exerce a sua ação antitumoral através da inibição da enzima nuclear topoisomerase II. Estudos recentes demonstraram que o efeito citotóxico in vitro deste agente é bem mais pronunciado quando as linhagens tumorais são expostas à droga por um tempo mais prolongado. Isto vem sendo confirmado em estudos clínicos, nos quais foi documentado um aumento significativo no percentual de respostas tumorais objetivas em pacientes com câncer avançado tratados com etoposide em doses repetidas diárias de forma continuada, comparativamente a pacientes que receberam pulsos de doses altas da droga a intervalos mais longos. Infelizmente, estudos iniciais com etoposide não revelaram uma atividade antitumoral significativa em pacientes com câncer renal avançado. Por esta razão, os estudos preliminares explorando o potencial terapêutico de seu análogo teniposide nesta doença também não receberam a devida atenção na literatura. Entretanto, este análogo possui potenciais vantagens terapêuticas em relação ao etoposide, uma vez que apresenta um tempo de retenção intracelular mais prolongado em linhagens de tumores sólidos in vitro. Estas observações nos estimularam a reconsiderar o estudo do potencial citotóxico do teniposide em modelos experimentais de câncer renal avançado. Nesta dissertação, foram estudados vários protocolos de administração de teniposide em linhagens de câncer renal humano, uma vez que esta neoplasia carece de drogas ativas disponíveis no armamentário terapêutico. Foram utilizadas as linhagens celulares RXF-393, A-498 e TK-10, as quais foram incubadas com teniposide em concentrações pré-determinadas e tempos de incubação variáveis. Além disto, foram feitos experimentos em que protocolos de administração de teniposide como agente único foram comparados a protocolos em que o mesmo foi combinado com agentes que bloqueiam a ação da glicoproteína P, responsável pelo efluxo ativo da droga do interior da célula tumoral. Além disso, foram também estudados protocolos incluindo a associação de teniposide com agentes que interferem com a síntese do DNA. Para os estudos de avaliação de citotoxicidade dos agentes quimioterápicos, os mesmos foram pré-incubados por 24 h na ausência ou presença do inibidor da DNA polimerase α afidicolina glicinada (0,2 µM) ou do inibidor da ribonucleotídeo redutase hidroxiuréia (200 µM) e após incubados por diferentes tempos de exposição com diluições seriadas de teniposide. Os efeitos citotóxicos foram avaliados através do método colorimétrico com sulforodamina B (SRB). Os protocolos de exposição prolongada das células ao teniposide mostraram um aumento significativo na sua citotoxicidade nas linhagens RXF-393, A-498 e TK-10, sugerindo que a citotoxicidade do teniposide é dependente de tempo de administração. Neste sentido, uma maior taxa de dano no DNA foi observada nas células expostas ao teniposide por tempos de administração mais prolongados. Curiosamente, os diferentes tempos de exposição ao teniposide não influenciaram de forma clara na formação de complexos DNA-topoisomerase II, nem nas medidas da atividade desta enzima. O uso concomitante de agentes moduladores da glicoproteína P como o verapamil, a ciclosporina A e o tamoxifeno não produziu potencialização do efeito antiproliferativo do teniposide. Por sua vez, os tratamentos com agentes que interferem na síntese de DNA, como a afidicolina glicinada ou a hidroxiuréia, potencializaram a citotoxicidade do teniposide em todas as linhagens estudadas, seguindo as características intrínsecas de cada linhagem. Em conclusão, os resultados apresentados nesta dissertação sugerem que o teniposide apresenta um maior efeito citotóxico em protocolos de administração prolongada em combinação com agentes inibidores da síntese de DNA. Frente a estes resultados iniciais, o teniposide será testado nos protocolos de administração acima mencionados em um painel contendo um maior número de linhagens tumorais in vitro. Uma vez confirmadas as observações acima descritas, serão iniciados estudos em modelos tumorais in vivo. Estes estudos servirão de base nas decisões quanto à reavaliação clínica do teniposide em ensaios de fase I em pacientes com neoplasias avançadas refratárias.

Efeitos in vivo do ácido metilmalônico sobre o comportamento de ratos no labirinto aquático de morris e in vitro sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo e sobre as atividades dos complexos I-IV da cadeia respiratória em homogeneizado de tecidos de ratos

A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e clinicamente por deterioração neurológica progressiva e falência renal. Os avanços no tratamento dessa doença alcançados nos últimos anos possibilitaram uma diminuição significativa na mortalidade dos mesmos. Entretanto, a morbidade continua alta, pois a maioria dos pacientes afetados por acidemia metilmalônica, mesmo recebendo o melhor tratamento disponível no momento, apresenta graus variáveis de comprometimento do sistema nervoso central refletido em retardo mental e atraso no desenvolvimento psicomotor. No presente estudo investigamos os efeitos in vivo da administração crônica do MMA em ratos Wistar durante o seu desenvolvimento (do 5º ao 28º dia de vida pós-natal) sobre o comportamento dos mesmos na tarefa do labirinto aquático de Morris. A tarefa foi realizada após um período de recuperação dos animais de 30 dias com o intuito de verificar dano neurológico permanente ou de longa duração nos animais. O labirinto aquático de Morris é uma tarefa bastante útil para a avaliação de aprendizado e memória espaciais. O protocolo da tarefa foi ligeiramente modificado para servir ao propósito de nosso trabalho, ou seja, o de avaliar o efeito da administração crônica de drogas sobre o comportamento de ratos. Verificamos que a administração crônica de MMA não provocou efeito no peso corporal, velocidade de natação e na fase de aquisição da tarefa. Porém, o tratamento prejudicou o desempenho dos animais no treino reverso, o que é condizente com comportamento perseverativo. Também avaliamos o efeito do ácido ascórbico, que foi administrado isoladamente ou em combinação com o MMA para testarmos se o estresse oxidativo poderia estar relacionado com as alterações comportamentais observadas no grupo tratado com MMA. Observamos que este antioxidante preveniu as alterações comportamentais provocadas pelo MMA, indicando que o estresse oxidativo pode estar envolvido com o efeito encontrado. Passamos então a avaliar o efeito in vitro do MMA sobre parâmetros de estresse oxidativo, mais especificamente na técnica de dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), que é um parâmetro de lipoperoxidação, e sobre o potencial antioxidante total do tecido (TRAP) e a reatividade antioxidante do tecido (TAR), que são parâmetros de defesas antioxidantes teciduais. O MMA na concentração de 2,5 mM aumentou a lipoperoxidação in vitro em homogeneizado de estriado e hipocampo de ratos e diminuiu o TRAP e o TAR em homogeneizado de estriado de ratos. Tais resultados indicam fortemente que o MMA induz estresse oxidativo. Finalmente investigamos o efeito in vitro do MMA sobre a atividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória em várias estruturas cerebrais e em órgãos periféricos em ratos de 30 dias de vida no sentido de melhor esclarecer os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais desta doença. Verificamos que o MMA causou uma inibição significativa da atividade do complexo II da cadeia respiratória em estriado e hipocampo quando baixas concentrações de sucinato foram utilizadas no meio de incubação. Além disso, verificamos que este efeito inibitório do MMA sobre o complexo II ocorreu somente após exposição do homogeneizado ao ácido por pelo menos 10 minutos, além do que esta inibição não foi prevenida pela co-incubação com o inibidor da óxido nítrico sintetase Nω- nitro-L-argininametilester (L-NAME) ou por uma associação de catalase e superóxido dismutase. Estes resultados sugerem que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio mais comuns não estão envolvidas neste efeito, tornando improvável que a inibição do complexo II da cadeia respiratória seja mediada por estresse oxidativo. O MMA também causou uma inibição do complexo II-III em estriado, hipocampo, rim, fígado e coração; e inibiu o complexo I-III em fígado e rim. O complexo IV não foi afetado pela incubação com o ácido em nenhuma das estruturas testadas. Portanto, tomados em seu conjunto, estes resultados indicam que o MMA bloqueia a cadeia respiratória. Os resultados de nosso trabalho indicam que a administração crônica de MMA em ratos em desenvolvimento provocou alterações comportamentais de longa duração provavelmente mediadas por radicais livres, pois tais alterações foram prevenidas pelo antioxidante ácido ascórbico. O MMA também induziu estresse oxidativo in vitro em estriado e hipocampo e inibiu de forma diferenciada os complexos da cadeia respiratória nos tecidos estudados, sendo que as estruturas mais vulneráveis a esta ação foram o estriado e o hipocampo. Finalmente, nossos resultados sugerem que antioxidantes podem ajudar a prevenir, ou pelo menos atenuar, os danos teciduais provocados pelo MMA na acidemia metilmalônica.